Техника и сущность окраски по Грамму

<

110714 1400 1 Техника и сущность окраски по Грамму1. Реактивы, используемые при окраске по Грамму, последовательность их нанесения и механизм воздействия на бактериальную окраску

2. Зависимость различного отношения к окраске по Грамму от различий в химическом составе и строении бактериальных клеток. Понятие о тинкториальных свойствах бактерий

 

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей — грамположительны и окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, многие неспороносные бактерии — грамотрицательны и окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма — розовый.

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (-) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Подготовка материала для окраски. Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.

Фиксация. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации:

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2с.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70—80 °С).

Химический способ фиксации:

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

Процесс окрашивания

  1. На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2—3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.
  2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1—2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1—2 минуты до почернения препарата.
  3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока и мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20-40-60 секунд).
  4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1—2 мин.
  5. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2—5 мин).
  6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

    Тинкториальные свойства — свойства бактерий, грибов и простейших, характеризующие их способность вступать в реакцию с красителями (см. Красители) и окрашиваться определенным образом.

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    2. Требования к питательным средам. Приготовление простых питательных сред

     

  7. Назначение питательных сред
  8. Требования, предъявляемые к питательным средам (обеспечение питательными средам (обеспечение питательными средами условий для роста и размножения микробов)
  9. Определение и название простых питательных сред
  10. Этапы приготовления пептонной воды (ПВ), мясо-пептонного бульона (МПБ) и мясо-пептонного агара (МПА). Преимущества и недостатки данных сред

     

     

    В лабораторных или производственных условиях бактерии выращивают (культивируют) на средах, которые должны удовлетворять потребности бактерий в питательных веществах, иметь адекватное значение величины рН, изотоничность и быть стерильными, а по-возможности и прозрачными. Специфичность большинства питательных сред определяют соединения углерода и азота, но так как конструктивные и энергетические процессы микроорганизмов разнообразны, неодинаковы и их потребности в питательных веществах.

    Требования, предъявляемые к питательным средам.

    1. Питательные среды должны содержать необходимые для питания микробов питательные вещества.

    2. Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.

    3. Питательные среды должны иметь достаточную влажность и вязкость, т.к. микробы питаются по законам диффузии и осмоса.

    4. Обладать изотоничностью и иметь определенный окислительно-восстановительный потенциал (гН2).

    5. Питательные среды должны быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур.

    Питательные среды принято делить на несколько групп: среды которые отличаются по составу и происхождению, физическому состоянию или консистенции и функциональному или целевому назначению.

    По происхождению среды бывают естественными (натуральными) и искусственными (синтетическими) . К естественным средам относят те, в состав которых входят продукты растительного или животного происхождения. Они содержат все компоненты, необходимые для роста и развития бактерий, но имеют непостоянный химический состав, то есть они нестабильны. Поэтому такие питательные среды не пригодны для изучения метаболизма бактерий, а используются, в основном, для накопления биомассы, поддержания культур бактерий в жизнеспособном состоянии и для диагностических целей, например, для выделений чистых культур бактерий. К естественным средам относятся молоко, кровь и сыворотка крови, отвары и экстракты из природных субстратов, пептонная и мясная вода, мясо-пептонные бульон и агар, дрожжевые экстракты, картофельные, яичные и желчесодержащие среды.

    Синтетические (искусственные) среды имеют определенный химический состав и точное количественное содержание питательных веществ. Их используют для изучения метаболизма бактерий, исследования физиологии и биохимии микроорганизмов. Примером синтетической среды могут служить среды Козера и Симмонса , используемые для изучения способности бактерий утилизировать цитраты. В состав этих сред, наряду с другими солями, входят цитрат натрия и индикатор.

    В практике микробиологии, как правило, используются комбинированные питательные среды, в которых сочетаются естественные компоненты с неорганическими солями. Примерами таких сред являются агар Цейсслера , в состав которого входит МПА, кровь и сахар, среды Гисса , содержащие пептон, агар , один из сахаров и индикатор, среда Раппопорта , состоящая из желчного бульона, глюкозы и индикатора.

    Среды можно по составу разделить так же на простые и сложные. К простым относятся мясная и пептонная вода, мясо-пептонные бульон и агар . Добавление к таким средам одного или нескольких ингредиентов — углеводов, крови, сыворотки и других составляющих делают их сложными.
    По физическому состоянию питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными или твердыми, сыпучими или сухими .

    Жидкие среды представлены, как правило, водными растворами необходимых для жизни веществ. Их используют для накопления биомассы, обогащения культур бактерий, изучения метаболизма. Полужидкие и плотные питательные среды получают из жидких , добавляя к ним агар или желатину. Концентрация агара для полужидких сред 0,5-0,7%, а для плотных 1,5-2%.

    Полисахарид агар получают из некоторых видов морских водорослей, его высушивают и хранят в виде пластин или порошка. Бактерии не используют агар в качестве субстрата и поэтому состав плотной питательной среды зависит от состава жидкой среды, к которой добавлен агар . Агар плавится примерно при температуре 100 ° С и застывает при 40 ° С. Агаризированные среды разливают в пробирки или чашки Петри в расплавленном состоянии, а затем охлаждают. Для уплотнения сред иногда используют желатину, добавляя ее к жидким средам в 10-20% концентрации. Применение желатины ограничено тем, что она разжижается протеолитическими ферментами бактерий и ее применяют , в основном, в питательных средах для диагностических целей. Для уплотнения сред используют, кроме того, селикогель и каррагенан , получаемый из красных морских водорослей. Пластины геля, пропитанные питательной средой, используют для культивирования бактерий-автотрофов.

    Сухие питательные среды представляют смеси составляющих питательных сред определенного состава. Перед использованием их растворяют в воде в соответствии с инструкцией, указанной на этикетке, устанавливают необходимое значение рН и стерилизуют. Применение сухих питательных сред облегчает работу по приготовлению сложных сред в лабораториях.

    По целевому назначению питательные среды делят на несколько групп:

    – основные или универсальные простые среды , например, МПА, МПБ; на них могут расти многие виды неприхотливых микроорганизмов;

    – специальные или сложные среды используют для культивирования тех бактерий, которые не могут расти на основных простых средах; в состав специальных сред вводят, например, углеводы для роста стрептококков, желчь для культивирования сальмонелл, дефибринированную кровь для дифтерийной палочки.

    Пептонная вода — жидкая питательная среда, состоящая из 0,5-1% пептона, 0,5% натрия хлорида, растворенных в дистиллированной воде. Применяют как среду обогащения для холерного вибриона (рН около 9), основу для приготовления сахарных (рН 7,4) и др. сред. Стерилизуют Пептонную воду. при 120°С в течение 20 мин

    Мясопептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо  пептонных  сред используют мясной бульон , который получают так: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилии заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50—55°С.

    Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят в течение 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй — через бумажный фильтр). Фильтр доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Ватные пробки должны быть плотными, так как они являются фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации. Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, то предварительная стерилизация излишня. Нередко в лабораторных условиях мясной настой кипятят вместе с мясом, а затем мясо отжимают. Бульон получается хорошего качества. Если желательно иметь мясной бульон особо высокой питательности, во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин дополнительно гидролизует белковые соединения мяса, и количество усвояемых бактериями питательных веществ возрастает.

    Мясо можно заменить мясным экстрактом, беря его по 5 г на 1 л среды. Для приготовления мясопептонного бульона к 1 л мясного бульона добавляют 5—10 г пептона (пептон — первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярной массой) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли с целью создания осмотической активности. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор NagCOa (до посинения влажной красной лакмусовой бумажки; при этом фенолфталеин еще не показывает щелочную реакцию — при добавлении его к среде в фарфоровой чашке розовая окраска не выявляется). Удобно использовать индикатор бромтимолблау. 1—2 капли его вносят стеклянной палочкой в фарфоровую чашку и добавляют каплю бульона. В нейтральной среде бромтимолблау бутылочно-зеленый, в кислой — желтый, в щелочной — синий. После установления реакции среду снова кипятят 5—10 мин и белки, свернувшиеся от изменения реакции, отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком.

    Прозрачный мясо  пептонный  бульон  разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин

    Мясо — пептонный  агар (МПА). К 1 л мясо пептонного  бульона добавляют 15—20 г мелко нарезанного агар-агара. Среду нагревают до растворения агара (температура плавления его 100°С, застывания —40°С),устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na2COa и через воронки разливают в пробирки (но 10 мл для разливок в чашки — агар столбиком и по 5 мл для получения скошенного, наклонного агара). При разливе агара необходимо следить затем, чтобы края пробирки были сухими, иначе пробки прилипают к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 20 мин.

     

     

     

     

     

     

     

     

    14. Санитарно-биологический контроль дистиллированной воды. Понятие о пирогенности

     

    1. Микробное число воды. Методика его определения. Критерии чистоты дистиллированной воды

    2. Пирогенны. Химическая природа, просихождение, физические, биологические свойства, действие на организм.

    3. Меры по предотвращению пирогенности инъекционных лекарственных средств.

     

    В связи с тем, что определение патогенных бактерий при биологическом анализе воды   представляет собой непростую и трудоемкую задачу, в качестве критерия бактериологической загрязненности используют подсчет общего числа образующих колонии бактерий (Colony Forming Units — CFU) в 1 мл воды. Полученное значение называют общим микробным числом.

    В основном для выделения бактерий и подсчета общего микробного числа используют метод фильтрации через мембрану.

    110714 1400 2 Техника и сущность окраски по Грамму

    Рисунок 1– Иллюстрация метода фильтрации через мембрану

     

    При этом методе анализа воды определенное количество воды пропускается через специальную мембрану с размером пор порядка 0.45 мкм. В результате, на поверхности мембраны остаются все находящиеся в воде бактерии. После чего мембрану с бактериями помещают на определенное время в специальную питательную среду при температуре 30-37 оС.

    Во время этого периода, называемого инкубационным, бактерии получают возможность размножиться и образовать хорошо различимые колонии, которые уже легко поддаются подсчету.

    Так как такой метод анализа воды предполагает только определение общего числа колонии — образующих бактерий разных типов, то по его результатам нельзя однозначно судить о присутствии в воде патогенных микробов. Однако, высокое микробное число свидетельствует об общей бактериологической загрязненности воды и о высокой вероятности наличия патогенных организмов.

    Пирогенны — это бактериальные эндотоксины или фрагменты микробных тел, например, клеточных стенок. Пирогены, наряду с вирусами могут загрязнять воду делая её непригодной для некоторых применений (приготовление инъекционных растворов). Пирогенные вещества в воде могут определяться как традиционным способом путём введения кроликам и наблюдения за изменением температуры тела, так и современным, более чувствительным и надёжным специфическим тестом с использованием амёбоцитов, полученных из крови мечехвоста. Пирогены вызывают резкое повышение температуры при инъекции млекопитающим, в том числе и человеку и препятствуют развитию клеточных культур и культур тканей. Пирогены и вирусы могут быть удалены из воды путём дистилляции, ультрафильтрации, обратного осмоса и адсорбции.

    В производстве инъекционных препаратов от пирогеннов освобождаются различными физико-химическими методами – путем пропускания раствора через колонки с активированным углем, целлюлозой, мембранные ультрафильтры.

     

     

     

     

     

     

    17. Живые вакцины: получение, применение, достоинства, недостатки

     

  11. Вакцины, их назначение
  12. Живые вакцины (аттенуированные, дивергентные, векторные, рекомбинантные), получение, примеры.
  13. Преимущества и недостатки живых вакцин.

     

    Вакцины (лат. vaccinus коровий) — препараты, получаемые из микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности; применяются для активной иммунизации людей и животных с профилактической и лечебной целями. Вакцины состоят из действующего начала — специфического антигена; консерванта для сохранения стерильности (в неживых вакцинах.); стабилизатора, или протектора, для повышения сроков сохраняемости антигена; неспецифического активатора (адъюванта), или полимерного носителя, для повышения иммуногенности антигена (в химических, молекулярных вакцинах). Специфические антигены, содержащиеся в вакцинах, в ответ на введение в организм вызывают развитие иммунологических реакций, обеспечивающих устойчивость организма к патогенным микроорганизмам. В качестве антигенов при конструировании вакцины используют: живые ослабленные (аттенуированные) микроорганизмы; неживые (инактивированные, убитые) цельные микробные клетки или вирусные частицы; извлеченные из микроорганизмов сложные антигенные структуры (протективные антигены); продукты жизнедеятельности микроорганизмов — вторичные метаболиты (например, токсины, молекулярные протективные антигены): антигены, полученные путем химического синтеза или биосинтеза с применением методов генетической инженерии.

        В соответствии с природой специфического антигена вакцины делят на живые, неживые и комбинированные (как живые, так и неживые микроорганизмы и их отдельные антигены). Живые вакцины получают из дивергентных (естественных) штаммов микроорганизмов, обладающих ослабленной вирулентностью для человека, но содержащих полноценный набор антигенов (например, вирус коровьей оспы), и из искусственных (аттенуированных) штаммов микроорганизмов. К живым вакцинам можно отнести также векторные вакцины, полученные генно-инженерным способом и представляющие собой вакцинный штамм, несущий ген чужеродного антигена (например, вирус оспенной вакцины со встроенным антигеном вируса гепатита В).

    <

    Живые вакцины — аттенуированные (ослабленные) штаммы вирусов или бактерий. Аттенуированные — ослабленные в своей вирулентности инфекционной агрессивности), т.е. искусственно модифицированные человеком или «подаренные» природой, изменившей их свойства в явственных условиях, примером чего служит осповакцина. Действующим фактором таких вакцин являются изменённые генетические признаки микроорганизмов, в то же время обеспечивающие перенесение ребенком «малой болезни» с последующим приобретением специфического противоинфекционного иммунитета.

    Другими словами, вакцинные варианты живых микроорганизмов — это те из них, которые утрачивают исходную патогенность, присущую штаммам, циркулирующим в природе. Но, оставаясь жизнеспособными) они индуцируют образование специфической резистентности по той же схеме, как это происходит при естественно-инфекционном процессе. Пример: после прививки БЦЖ — против туберкулеза. Существенное отличие состоит в том, что перенесение инфекционного заболевания естественным путем, которое может протекать и в скрытой (стертой) форме (дифтерия, полиомиелит, паротит и др.), обеспечивает, как правило, пожизненную невосприимчивость. Повторное заболевание отмечено всего лишь у пяти процентов. При вакцинации живыми вакцинами искусственно приобретенный иммунитет непродолжителен, что обусловливает дополнительное неоднократное повторение процедуры прививок.

    Рекомбинантные генно-инженерные вакцины — новая продукция в профилактике инфекционных болезней. Примером такой вакцины является вакцина против гепатита В.

    Смысл живых вакцин состоит в том, чтобы воспроизвести в организме натуральную инфекцию в ослабленной форме. Преимуществами живых вакцин является отличная профилактическая эффективность, а к недостаткам следует отнести невозможность применения их у детей и больных хроническими заболеваниями, невозможность применения таких вакцин во время эпидемии.

    Наиболее просты в изготовлении живые вакцины, так как технология в основном сводится к выращиванию аттенуированного вакцинного штамма с соблюдением условий, обеспечивающих получение чистых культур штамма, исключение возможностей загрязнения другими микроорганизмами (микоплазы, онковирусы) с последующей стабилизацией и стандартизацией конечного препарата. Вакцинные штаммы бактерий выращивают на жидких питательных средах (гидролизаты казеина или другие белково-углеводные среды) в аппаратах — ферментаторах емкостью от 0,1 м3 до 1—2 м3. Полученная чистая культура вакцинного штамма подвергается лиофильному высушиванию с добавлением протекторов. Вирусные и риккетсиозные живые В. получают выращиванием вакцинного штамма в эмбрионах кур или перепелов, свободных от вирусов лейкоза, либо в культурах клеток, лишенных микоплазм. Используют или первично-трипсинизированные клетки животных или перевиваемые диплоидные клетки человека. Живые аттенуированные штаммы бактерий и вирусов, применяемые для приготовления живых вакцин, получены, как правило, из природных штаммов путем их селекции или пассажей через биологические системы (организм животных, эмбрионы кур, культуры клеток, питательные среды).

        В связи с успехами генетики и генетической инженерии появились возможности целенаправленного конструирования вакцинных штаммов. Получены рекомбинантные штаммы вируса гриппа, а также штаммы вируса вакцины со встроенными генами протективных антигенов вируса гепатита В. Инактивированные корпускулярные бактериальные В. или цельновирионные инактивированные В. получают соответственно из культур бактерий и вирусов, выращенных на тех же средах накопления, что и в случаях получения живых вакцин, и затем подвергнутых инактивации нагреванием (гретые вакцины), формалином (формолвакцины), ультрафиолетовым излучением (УФ-вакцины), ионизирующим излучением (радиовакцины), спиртом (спиртовые вакцины). Инактивированные вакцины ввиду недостаточно высокой иммуногенности и повышенной реактогенности не нашли широкого применения.

    3. Характеристика возбудителей лептоспирозов: эпидемиология, патогенез, клиника, иммунитет. Принципы микробиологической диагностики. Препараты для специфической профилактики и лечения

     

    1. Характеристика возбудителей: а) таксономия; б) морфологические и тинкториальные свойства; в) антигенная структура; г) культивирование; д) биохимические (ферментативные) свойства; е) факторы патогенности; ж) резистентность; з) патогенность для животных.

    2. Эпидемиология: а) источник инфекции; б) механизм передачи; в) восприимчивость населения.

    3. Патогенез заболевания.

    4. Клиническая картина.

    5. Иммунитет.

    6. Лабораторная диагностика: бактериоскопический, бактериологический, биологический и серологический методы.

    7. Лечение (в т.ч. специфическое).

    8. Неспецифическая и специфическая профилактика.

     

    К лептоспирозам относят все те инфекционные заболевания людей, домашних и диких животных (в основном из класса млекопитающих), которые вызываются спирохетами рода лептоспира (Leptospira).

    Лептоспирозы вызываются различными видами лептоспир, отличающимися друг от друга, прежде всего своими серологическими свойствами (по антигенному строению).

    Хранителями (резервуарами) лептоспир в природе являются животные—дикие (грызуны, насекомоядные, хищные) и домашние (рогатый скот, лошади, свиньи и собаки).

    Лептоспирозы передаются человеку от животных и потому их относят к группе зоонозов.

    Эпидемиологически лептоспирозы характеризуются преимущественно водным путем распространения. С этой точки зрения лептоспироз можно охарактеризовать, как «болезнь грязной воды», в том смысле, что в такой воде содержится некоторое количество мочи, с которой лептоспиры выделялись из организма.

    Циркуляция патогенных лептоспир в природе происходит, в основном следующим образом: из организма животных—больных и носителей—во внешнюю среду и, в частности, в водоемы, а затем из внешней среды вновь в организм животных, а иногда и в организм людей. Человек для патогенных лептоспир в эпидемиологическом отношении в большинстве случаев оказывается «тупиком».

    По решению Международного подкомитета по таксономии спирохет и лептоспир последние выделены в самостоятельное семейство Leptospiraceae в порядке Spirochaetalis. В определителе бактерий Берджи (1997) род Leptospira включен в группу спирохеты обьединяющую 8 родов—Borrelia, Brachyspira, Cristispira, Leptonema, Leptospira, Serpulina, Spirochaeta, Treponema. В свою очередь род Leptospira включает десять видов—L. biflexa, L. borgpetersenii, L. inadai, L. interrogans, L. meyeri, L. noguchii, L.parva, L. santarosai, L. weilii, L. wolbachii. Отдельные исследователи (А.П. Казанцев 1997 и др.) подразделяют бактерии данного рода на две группы (два комплекса)—патогенные (паразитические) лептоспиры и лептоспиры—сапрофиты. Представителями первой группы являются—L. interrogans, а второй L. Biflexa.

    Таксономическим критерием для классификации штаммов лептоспир на внутривидовом уровне служит их антигенный состав. В качестве стандартного метода для определения сероваров используют выявляемую с помощью световой микроскопии реакцию агглютинации с перекрестной адсорбцией агглютининов. Для удобства близкие по составу антигенов серовары объединены в серогруппы. В настоящее время (Справочник Берджи 1997 г.) патогенные лептоспиры разделены на 38 серогрупп и 65 сероваров. Идентификация выделенных штаммов лептоспир проводится в справочных лептоспирозных лабораториях.

    Лептоспиры—микроорганизмы спиралевидной формы. Обычно длина их составляет 6-24 мкм, а диаметр—до 0,2 мкм. Концы микроба изогнуты в виде крючков, которые придают ему своеобразный, легко распознаваемый вид. С помощью электронной микроскопии установлено, что лептоспиры состоят из спирального протоплазматического цилиндра, покрытого цитоплазматической гликопептидной мембраной. Все тело клетки заключено в наружную мембрану между цитоплазматической мембраной и мембраной наружного покрова расположены два жгутика («осевые нити»). Каждый жгутик прикреплен к базальному телу и переплетается с протоплазматическим цилиндром. Их свободные концы расположены около середины клетки. Лептоспиры плохо воспринимают анилиновую краску, поэтому их изучают преимущественно в темном поле зрения в так называемой раздавленной капле. Эти спирохеты имеют вид тонких, оживленно движущихся серебристых нитей. Их движения разнообразны: прямолинейные, вращательные, сгибательные. В сильно вязкой среде движение может происходить по типу волнового, винтового и змеевидного.

    Относятся они к хемоорганотрофам, в качестве источника углерода и энергии используют жирные кислоты и жирные спирты с 15 или более атомами углерода. Углеводы или аминокислоты для данных целей не используются. Культивируются в средах, содержащих сыворотку, сывороточный альбумин или жирные кислоты. В средах с 1% агара образуют глубинные колонии, от диффузных до четко очерченных. В средах с 2% агаром колонии поверхностные, от мутных до прозрачных. Оптимальная температура роста 28-30°С, (сапрофитные серовары могут расти при 13°С) рН—7,2-7,6. Инкубационный период для оптимального роста обычно 6-14 дней, но может варьировать от нескольких дней до 4 недель.

    Лептоспиры—аэробные микроаэрофильные микроорганизмы. Они могут утилизировать неорганические соли аммония как главный источник азота, а также пуриновые основания.

    Размножаются лептоспиры поперечным делением, и происходит это медленнее чем у других бактерий. Максимальной концентрации культура достигает на 6-12-е сутки.

    Культивируют лептоспиры чаще всего на жидких питательных средах, содержащих в качестве основного компонента сыворотку крови кролика или овцы.

    В воде и влажной почве могут быть обнаружены L. biflexa, морфологически они неотличимы от L. interrpgans.

    Важным условием выживания лептоспир во внешней среде является повышенная влажность и рН 7,0-7,6. Они быстро погибают под действием прямых солнечных лучей. В воде открытых водоемов лептоспиры сохраняют жизнеспособность от 7 до 30 дней, а во влажной почве—9 мес. Они чувствительны к действию высоких температур: кипячение убивает их мгновенно, нагревание до 56-60°С в течение 20-25 мин. Напротив, к низким температурам эти микроорганизмы устойчивы, остаются жизнеспособными после длительного замораживания во льду. Лептоспиры чувствительны к кислотам, поэтому для обеззараживания чистых культур рекомендуют 2% раствор соляной кислоты с экспозицией 24 часа, а для патологического материала следует применять 5% раствор фенола в течение 2 часов.

    Эпизоотологические данные. Лептоспирозом болеют крупный рогатый скот, буйволы, свиньи, лошади, овцы, козы, олени, собаки, верблюды, кошки, грызуны, пушные звери, насекомоядные, сумчатые и др. Чаще поражаются свиньи и крупный рогатый скот; у молодых животных болезнь протекает тяжелее и с большей летальностью.

    Источником возбудителя инфекции являются клинически и бессимптомно больные, а также переболевшие животные—лептоспироносители.

    Из организма лептоспиры выделяются с мочой, фекалиями, молоком, спермой, истечениями из половых органов, а также с абортированным плодом. Особенно опасными являются лептоспироносители, длительное время выделяющие лептоспиры с мочой: грызуны—всю жизнь, свиньи—до 2 лет, овцы—до 9 мес., крупный рогатый скот—до 20 мес., собаки—до 3 лет, кошки—до 119 дней, лисицы—до 514 дней. В неблагополучных хозяйствах лептоспироносительство составляет у крупного рогатого скота от 1-2% до 10-50%, у свиней—20-80% и более.

    Источником лептоспирозной инфекции для человека являются животные—дикие, домашние и клеточного пушного звероводства.

    Люди в большинстве случаев заражаются при купании и использовании для хозяйственных и бытовых нужд воду из открытых водоемов, инфицированной животными—лептоспироносителями, и реже, во время сельскохозяйственных работ на сырых угодьях, охоте, рыбной ловле, при уходе за домашними животными, разделке туш и обработке животного сырья, при употреблении продуктов питания, инфицированных грызунами, а также сырого молока от больных коров.

    Территории, на которых выявляется лептоспироз среди животных, следует считать лептоспирозными очагами, потенциально опасными для человека.

    Лептоспирозные очаги подразделяются на природные, антропургические и смешанные.

    В России в инфекционной патологии человека наибольшее значение имеют природные очаги лептоспироза серогруппы Grippotyphosa и в меньшей степени Pomona, HebdoMadis, Icterohemorragiae.

    Заболевания людей в природных очагах характеризуются строгой приуроченностью к летне-осеннему периоду (июнь-сентябрь).

    В хозяйствах, где преобладают свиньи, главная роль в этиологии заболеваний человека принадлежит лептоспирозу серовара monjakov (серогруппа Роmonа), реже возбудителям групп Tarassovi и Canicola, в хозяйствах преобладанием крупного рогатого скота—сероварам grippotyphosa, pomona, группам Hebdomadis и иногда Tarassovi.

    Смешанные очаги проявляются одновременно в виде антропургических и природных. Этиологическая структура заболевания людей отражает таковую, как у домашних, так и у диких животных обитающих в данном очаге.

    Кроме указанных типов очагов возможно внутрилабораторное заражение при работе с грызунами и другим животными и непосредственно с культурой лептоспир.

    Особенности эпидемиологии в зависимости от свойств возбудителей. Различные возбудители лептоспироза вызывают одинаковые по патогенезу заболевания и могут при определенных условиях поражать разнообразных животных, но они довольно существенно различаются по патогенным свойствам, избирательной привязанности к тем или иным видам животных-хозяев (т. е. по кругу основных носителей инфекции), закономерностям заражения людей, эпидемиологической значимости.

    С 1964 г. заболеваемость колебалась в пределах: 0,16 до 5,64 на 100 тысяч населения. Снижение произошло за счет проведения санитарно-ветеринарных мероприятий. В 80-90-е годы заболеваемость колеблется в пределах от 0,1 до 3,4 на 100 тысяч населения.

    Патогенез.        Воротами инфекции чаще является кожа. Для проникновения лептоспир достаточно малейших нарушений целостности кожи. В связи с этим заражение наступает даже при кратковременном контакте с водой, содержащей лептоспиры. Возбудитель может проникать также через слизистые оболочки органов пищеварения и конъюнктиву глаз. На месте ворот инфекции никаких воспалительных изменений («первичного аффекта») при этом не возникает. Дальнейшее продвижение лептоспир происходит по лимфатическим путям. Ни в лимфатических сосудах, ни в региональных лимфатических узлах воспалительных явлений также не развивается. Барьерная роль лимфатических узлов выражена слабо. Лептоспиры легко их преодолевают и заносятся в различные органы и ткани (преимущественно в печень, селезенку, легкие, почки центральную нервную систему), в которых происходит размножение накопление лептоспир. По времени это совпадает с инкубационным периодом. Эта фаза патогенеза равняется длительности инкубационного периода (от 4 до 14 дней).

    Начало болезни (обычно острое) связано с массивным поступлением лептоспир и их токсинов в кровь (при микроскопии крови обнаруживаются десятки лептоспир в поле зрения). Тяжесть болезни и выраженность органных поражений зависит не только от серотипа возбудителя, но и от реактивности макроорганизма. В печени лептоспиры прикрепляются к поверхности клеток, а также находятся в межклеточном пространстве. Часть лептоспир погибает. Лептоспиры, их токсины и продукты обмена приводят к выраженной интоксикации, которая особенно быстро нарастает в первые 2-3 дня от начала болезни. Лептоспиры обладают гемолизином, что приводит к разрушению (гемолизу) эритроцитов. Возбудители и их токсические продукты обладают выраженным действием на сосудистую стенку и на свертывающую систему крови. В тяжелых случаях развивается тромбогеморрагаческий синдром.

    Желтуха при лептоспирозе носит смешанный характер. Имеет значение отек печеночной ткани, деструктивные и некротические изменения паренхимы, а также гемолиз эритроцитов. Оcoбoe место в патогенезе лептоспироза занимает поражение почек. В большинстве случаев летальные исходы связаны с развитием острой почечной недостаточности (уремическая кома). Она возникает в результате непосредственного действия лептоспир и их токсических продуктов жизнедеятельности на клеточную стенку приводит к тяжелым повреждениям эпителия почечных канальцев, коркового и подкоркового вещества почек, что приводит к нарушению процессов мочео6разования. Следствием этого является олигурия с возможным развитием уремии. У части больных (10-35%) лептоспиры преодолевают гематоэнцефалический барьер, что приводит к поражению центральной нервной системы, обычно в виде менингитов. Кровоизлияния в надпочниках могут привести к развитию острой недостаточности коры надпочечников. Своеобразным и патогномоничным проявлением лептоспироза является поражение скелетных мышц. Иногда, в результате гематогенного заноса развивается специфическое лептоспирозное поражение легких, глаз, реже других органов.

    Клиническая картина лептоспироза чрезвычайно разнообразна. Однако у всех видов животных можно наблюдать три стадии болезни: продромальную, основных клинических симптомов и выздоровления. Заболевание начинается остро. В стадию продромальных симптомов температура повышается на 2– 3°, появляется слабость, исчезает аппетит. Рогатый скот на пастбище отстает от стада, у лактирующих животных резко снижается удой. Скот обычно стоит безучастный к окружающему; звери и собаки забиваются в угол клетки, предпочитая лежать. Сосуды конъюнктивы в некоторых случаях резко налиты.

    Болезненность мускулатуры может быть установлена у лошадей, собак и лисиц. У коров и кобыл в этой стадии бывают аборты. Наряду о потерей аппетита, у плотоядных отмечается рвота пищевыми массами с примесью желчи и крови. Перистальтика или замедляется или делается бурной. У лошадей возникают приступы легких колик. Развивается понос или, наоборот, запор. У собак к калу примешивается кровь.

    С появлением основных клинических симптомов: анемия, геморрагический диатез, желтуха, гемоглобинурия, некрозы, температура падает и держится в нормальных или даже субнормальных границах до смерти или выздоровления, и лишь очень редко бывают рецидивы лихорадки о ухудшением состояния больные.

    Инкубационный период при лептоспирозах у людей составляет от 3 до 14 дней, чаще всего 7 дней.

    Клинически лептоспирозы людей—общие острые лихорадочные, нередко рецидивирующие заболевания типа септицемии. Болезнь начинается внезапно и сопровождается ознобом, высокой температурой, общей слабостью, сильными головными и мышечными болями и поражением прежде всего печени, почек и мелких сосудов; нередко отмечаются геморрагии, сыпь на коже и расстройства со стороны желудочно-кишечного тракта, а в некоторых случаях желтуха.

    Течение лихорадки при всех видах лептоспирозов обычно довольно однообразное: быстрое нарастание, непродолжительность, подскоки и рецидивы. Клиническое развитие всех видов лептоспирозов также чаще всего довольно однообразное.

    Но в зависимости от функционального состояния организма и вирулентности лептоспир некоторые симптомы заболевания могут проявляться слабее или резче. Это и обусловливает существование различных клинических форм этой болезни (желтушная, геморрагическая, менингеальная, гриппоподобная, рецидивирующая).

    Известны случаи, когда заболевания лептоспирозами неправильно диагностировали и не отличали от гриппа, возвратного, сыпного или брюшного тифа, менингококкового менингита, малярии и т. д.; напротив, болезнь Боткина (вирусный гепатит) диагностировали как лептоспироз.

    Для лептоспироза человека характерно разнообразие клинических проявлений и выраженная цикличность.

    Первая фаза заболевания соответствует инкубационному периоду и продолжается в среднем 7– 14 дней. В это время благодаря активной подвижности лептоспиры быстро проникают в организм, не оставляя патологических изменений в месте входных ворот (в редких случаях развивается региональный лимфаденит). С током крови лептоспиры попадают в паренхиматозные органы—преимущественно в печень, почки, надпочечники, селезенку, легкие. Здесь они интенсивно размножаются. Преодолевая гематоэнцефалический барьер, возбудитель проникает в ликвор и ткани мозга.

    Вторая фаза соответствует началу клинических проявлений. В это время происходит накопление лептоспир и их токсических продуктов в крови, что и обусловливает выраженную интоксикацию. Заболевание начинается остро, без продромальных явлений. Появляется озноб, температура тела повышается до 39-40 С и держится повышенной в течение 5-7 дней, носит ремиттирующий или постоянный характер, снижается критически или по типу ускоренного лизиса. После периода апирексии, продолжающегося в среднем от 3 до 11 дней, могут наблюдаться повторные повышения температуры тела. Но в этом случае приступы лихорадки умеренные и более короткие.

    С первых дней болезни пациенты жалуются на сильную головную боль, бессонницу, боль в икроножных мышцах, мышцах плечевого пояса, в области груди, спины живота. Боли в мышцах, особенно икроножных, очень интенсивные, возникают в покое, усиливаются при малейшем движении и легкой пальпации. В этот же период появляется тошнота, рвота, горечь во рту, падает аппетит. Появляются боли в животе, которые могут быть настолько интенсивными, что имитируют картину «острого живота».

    Больные заторможены, адинамичны. Лицо одутловато, гиперемировано. Склеры инъецированы, возможны кровоизлияния в склеру, на губах и крыльях носа могут появляться герпетические высыпания, нередко с геморрагическим содержимым.

    К 3-6-му дню болезни у 2-10% больных на коже груди, живота, спины, конечностей отмечается полиморфная сыпь, которая держится от нескольких часов до 10 дней. После исчезновения сыпи наблюдается легкое шелушение кожи.

    Общепризнанно, что с конца первой начала второй недели заболевания наступает третья фаза—наивысшая ступень токсемия, соответствующая развернутой картине болезни и обусловленная поражением практически всех органов и тканей. В основе патологических изменений лежит генерализованный капилляротоксикоз. Он связан с повреждением эндотелия капилляров продуктами метаболизма лептоспир и их токсинами. Имеет место также нарушение системы регуляции агрегатного состояния крови с развитием синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС). Степень выраженности происходящих патологических изменений может быть различной: от легкой до ярко выраженной, при которой развивается гипертоксический вариант лептоспироза, протекающий по типу инфекционно-токсического шока с резким нарушением функции органов.

    Лептоспироз всегда сопровождается поражением печени, что проявляется в ее увеличении, болезненности, нарушении углеводной, белковой, пигментной и антитоксической функции. Степень патологических изменений определяет желтушную и безжелтушную форму инфекции. Желтуха разной интенсивности от легкой желтушности склер до ярко оранжевого, иногда шафранного цвета кожи появляется у 30-60% больных.

    Поражение почек—важный и почти постоянный симптом лептоспироза, при легком течении заболевания проявляющийся в альбуминурии, цилиндрурии, гематурии. В тяжелых случаях развивается острая почечная недостаточность разной степени выраженности до полной анурии.

    Геморрагический синдром проявляется в виде кровоизлияний на коже и слизистых оболочках и различных кровотечений (носовых, желудочных, маточных, кишечных), часто повторяющихся и обильных.

    Нередко возникает поражение центральной нервной системы в виде менингитов и менингоэнцефалитов с резко выраженными оболочечными, а иногда и очаговыми симптомами, значительными изменениями в спинномозговой жидкости. Встречается и латентная форма лептоспирозного менингита, протекающая без оболочечных симптомов, с сильной головной болью, повторной рвотой и высоким уровнем лимфоцитарного плеоцитоза.

    Нарушение сердечно-сосудистой деятельности проявляется в понижении артериального давления, брадикардии, глухости сердечных тонов, систолическом шуме на верхушке, в изменениях на электрокардиограмме, свидетельствующих о диффузном повреждении миокарда. Расстройство гемодинамики, в ряде случаев, приводит к развитию острой сердечнососудистой недостаточности.

    Легочный синдром по клиническим и рентгенологическим данным выявляется у 9-12% больных и встречается чаще при иктерогеморрагическом лептоспирозе. Наблюдаются явления трахеита, бронхита. Пневмонии обычно мелкоочаговые и быстро разрешающиеся.

    При своевременной и адекватной терапии болезнь у большинства перенесших инфекцию заканчивается выздоровлением. Период выздоровления длителен.

    Восстановление функции поврежденные органов может растягиваться на месяцы.

    Началу периода выздоровление соответствует четвертая фаза болезни формирование нестерильного иммунитета. При наличии возбудителя в почках в крови появляются специфические антитела. В это время иногда развиваются различные осложнения: миокардиты, эндокардиты, ириты, иридоциклиты, увеиты, помутнение стекловидного тела, невриты периферических нервов, парезы, отиты и др.

    Патологоанатомические данные. Летальность при лептоспирозе завит от многих причин и колеблется от 5 до 48%. Непосредственной причиной смерти является инфекционно-токсический шок, острый почечно-печеночная или почечная недостаточность, острая сердечнососудистая недостаточность, выраженный геморрагический синдром.

    При патологоанатомическом исследовании умерших больных выявляется острая паренхиматозный гепатит с дискомплексацией печеночных балок; дистрофические изменения цитоплазмы эпителиальных клеток извитых канальцев; мелкоочаговый миокардит с выраженными дистрофическими изменениями кардиоцитов; продуктивный специфический) острый миозит икроножных мышц; дистрофические изменения нервных клеток ткани мозга, иногда с картиной серозного менингита. Геморрагический синдром проявляется в кровоизлияниях в кожу, ткань легких, в эпикард, в слизистую оболочку печеночных лоханок, твердую мозговую оболочку. Почти всегда прогрессирующая анемия, сопровождающаяся очаговой гиперплазией костного мозга.

    Морфологическая картина по всем органам характеризуется лимфогистиоцитарными воспалительными инфильтратами, что позволяет считать эти изменения специфическими для лептоспироза.

    Лабораторная диагностика. В целях лабораторной диагностики, результаты которой являются решающими для подтверждения лептоспирозной этиологии заболевания применяют различные методы:

    1) микроскопия;

    2) бактериологические исследования;

    3) биопробы на лабораторных животных;

    4) серологические исследования. Медицинские и ветеринарные работники для серологической диагностики лептоспироза среди людей и животных пользуются единым набором эталонных штаммов лептоспир.

    Микроскопия. Обнаружение лептоспир в нативных препаратах осуществляют с помощью конденсора «темное поле», осветителя ОИ-13 или ОИ-19 при увеличении в 280—400 раз или после окраски флюоресцирующим глобулином в люминесцентных микроскопах МЛ-1, МЛ-2, МЛ-З, МЛД.

    В «темном поле» микроскопа исследуют мочу, околосердечную жидкость, транссудаты из грудной и брюшной полостей, цитрированную кровь в нативном состоянии или в виде осадка после центрифугирования в течение 30 мин при 10—15 тыс. об/мин, суспензии из почек, легких, печени больных и павших сельскохозяйственных или экспериментально инфицированных лабораторных животных, которые предварительно отстаивают 30 мин при 4°С, центрифугируют 10 мин при 3 тыс. об/мин, отбирают для исследования надосадочный слой. Из каждого исследуемого материала на стеклах (не толще 1,1 мм) готовят не менее 10 препаратов «раздавленная капля», просматривают до 50 полей зрения для обнаружения морфологически характерных подвижных лептоспир.

    Иммунофлюоресцентные исследования проводят с использованием специфического флюоресцирующего глобулина. Сухой глобулин предварительно растворяют стерильной дистиллированной водой до указанного на этикетке ампулы первоначального объема. Растворенный глобулин дополнительно разводят физиологичен т раствором (рН 7,4-7,6) до рабочего разведения, также указанного на этикетке ампулы, переносят в стерильную пробирку, консервируют мертиолятом в соотношении 1:10000 (0,1 мл 1%-ного раствора мертиолята на 10 мл глобулина), закрывают резиновой пробкой и хранят (до 1 мес) при температуре 2-10°С. Рабочее разведение глобулина без консерванта можно использовать только в течение 5 дн. при условии хранения его при температуре 2-5°С.

    Исследуют кровь, паренхиматозные органы, транссудат из грудной и брюшной полостей перикардиальную и спинномозговую жидкость, мочу больных и павших животных, органы и ткани абортированного плода, из которых готовят мазки.

    Мазки высушивают при комнатной температуре, фиксируют ацетоном 5 мин. или этиловым спиртом 15 мин. и снова высушивают на воздухе. На каждый мазок наносят 3-5 капель рабочего разведения флюоресцирующего глобулина, выдерживают при комнатной температуре 20 мин., промывают водопроводной водой и физиологическим раствором (рН 7,4-7,6), затем дистиллированной водой. Мазки подсушивают на воздухе наносят на них небольшую каплю смеси, состоящей из 9 частей глицерина и 1 части 0,05 М фосфатного буфера (рН 8,0), накрывают покровным стеклом, просматривают в люминесцентном микроскопе. Для контроля готовят 2-3 мазка одного из диагностических штаммов лептоспир и окрашивают их параллельно с мазками из патологического материала.

    Окрашенные флюоресцирующим глобулином лептоспиры имеют зеленоватое, не сияющее, свечение всей поверхности микроба (в отличие от контурного сияющего свечения микробов других видов). В препарате лептоспиры сохраняют свою форму, просматриваются отдельные вторичные (первичные не видны) завитки спирали. Характерные для живых лептоспир булавовидные утолщения на концах, наблюдаемые при темнопольной микроскопии, не видны.

    Результаты люминесцентной микроскопии учитывают на основании обнаружения морфологически характерных лептоспир и интенсивности их свечения, оцениваемой в крестах:

    (++++)—четкое зеленоватое свечение; (+++)—умеренное зеленоватое свечение; (+)—зеленоватые «тени»; (—)—нет морфологически характерных форм для лептоспир.

    Диагноз на лептоспироз считают установленным при обнаружении в патологическом материале микробов с морфологией, типичной для лептоспир, с интенсивностью свечения не менее чем на два креста.

    Бактериологическое исследование

    В 5– 7 пробирок с питательной средой для лептоспир засевают по 3-5 капель из каждого патологического материала, в котором предварительной микроскопией обнаружены лептоспиры. Из почек, легких, печени посевы проводят пастеровской пипеткой, которой отбирают кусочки величиной с просяное зерно с поверхности органов после предварительного прижигания их шпателем. Посевы инкубируют при 26-28°С. Наличие роста выявляют микроскопией в «темном поле» раздавленных капель, которые готовят из всех пробирок начиная с 10 дня до 90 дня культивирования.

    Серогрупповую принадлежность выделенных лептоспир определяют в перекрестной РМА с групповыми агглютинирующими сыворотками, серовариантную — в реакции иммуноадсорбции или РМА с моноклинальными сыворотками. Групповые агглютинирующие лептоспирозные сыворотки выпускают в наборе к лептоспирам 13 серогрупп: Grippotyphosa, Pomona, Icte-rohaemorrhagiae, Canicola, Tarassovi, Bataviae, Hebdomadis, Australis, Autumnalis, Pyrogenes, Ballum, Cynopteri, Yavanica.

    Типируемую культуру 5-10-суточного роста, содержащую не менее 50 лептоспир в поле зрения микроскопа и не имеющую признаков агглютинации и лизиса, проверяют в РМАЛ с каждой из 13 групповых агглютинирующих сывороток. Перед постановкой реакции сыворотку растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке, а затем готовят двукратные разведения физиологическим раствором по схеме, представленной в табл. 20. Затем в лунках смешивают 0,1 мл типируемой культуры лептоспир с равным (0,1 мл) объемом каждого разведения сыворотки. После тщательного перемешивания пластины помещают на 1 ч в термостат при 37°С. Результаты РМА оценивают в «темном поле» микроскопа по четырех балльной системе: (++++) —агглютинированы и лизированы 100% лептоспир; (+++) —агглютинированы и лизированы 75% лептоспир; (++) —агглютинированы и лизированы 50% лептоспир; (+) —агглютинированы и лизированы 25% лептоспир; (—) —агглютинации лизиса нет.

    Испытуемую культуру относят к серологической группе лептоспир гомологичной наименованию сыворотки, с которой она дает реакцию на 2-4 креста до 50– 100% гомологичного титра.

    Выделение типичной культуры лептоспир из патологического материала дает основание для установления диагноза.

    Биологическое исследование

    Проводят для выделения и очистки культур лептоспир, определения их вирулентности. Патологический материал (моча, кровь, суспензия из органов от больных или погибших животных) вводят в брюшную полость двум 8—10-дневным крольчатам в дозе 2— 2,5 мл или двум 3—4-недельного возраста золотистым хомячкам в дозе 0,5—1 мл. При отсутствии гибели животных убивают: одно на 4—5-й день, другое на 15—16-и день после заражения. Из каждого органа и крови павших или убитых зверьков делают высевы в 3—4 пробирки с питательной средой для лептоспир. Одновременно микроскопически исследуют в «темном поле» препараты из транссудатов грудной и брюшной полостей, околосердечной сумки, мочи из мочевого пузыря, а также из почек, печени, легких обоих зверьков, а сыворотку крови животного, убитого через 14—16 дней после заражения, исследуют и в РМА. Микроскопическое обнаружение лептоспир в патологическом материале зараженных зверьков или положительная РМА в разведении их сыворотки 1:10 и выше дают основания для заключения о положительных результатах биопробы, и диагноз на лептоспироз считают установленным.

    Серологическое исследование

    Предусматривает постановку РМА и РА с сыворотками крови животных при подозрении на лептоспироз, а также для систематического контроля эпизоотической ситуации в племенных хозяйствах. С этой целью в племенных хозяйствах исследуют сыворотки крови всех производителей и не менее 10% по РМА и 15% по РА коров, нетелей, свиноматок и кобыл один раз в год; на племенных предприятиях (станциях, пунктах) искусственного осеменения всех производителей—2 раза в год; перед вводом и выводом для племенных целей в группах до 25 гол.—всех животных, до 100 гол.—не менее 25 животных, в больших группах—не менее 25% животных по РМА и 35% животных по РА. При постановке РМА сыворотку разводят физиологическим раствором 1:50, 1:250, 1:1250. Антигенами служат живые музейные культуры лептоспир 4—6-й серогрупп, которые постоянно выращивают в диагностических лабораториях. Реакцию ставят на плексигласовых пластинках. Разведенную сыворотку разливают по 0,1 мл в 3 лунки начиная с большего разведения. Каждую разведенную сыворотку разливают в отдельный ряд, число которых определяется количеством антигенов, используемых для постановки диагноза. Каждую культуру-антиген вносят по 0,1 мл в 3 лунки с разным разведением сыворотки. Затем пластины встряхивают и ставят в термостат на 1 ч при 37°С. Контролем служит смесь 0,1 мл каждой культуры-антигена с равным объемом физраствора.

    Реакцию учитывают посредством обнаружения склеивания лептоспир и образования «паучков» при микроскопии в «темном поле» капель из каждой лунки, которые исследуют от большего разведения к меньшему. Результаты реакции оценивают в крестах по пятибалльной системе (++++) —агглютнировано 100% лептоспир; (Ч-++) — агглютинировано 75% лептоспир; (++) —агглютинировано 50% лептоспир; (+) —агглютинировано 25% лептоспир; (—) —агглютинация отсутствует. Положительной считают реакцию, оцененную не менее чем на два креста при отсутствии агглютинации в контроле. При повторном исследовании сывороток крови реакцию ставят в тех же разведениях.

    Сыворотку крови от вакцинированных свиней и овец с диагностической целью можно исследовать на лептоспироз спустя 2 мес., а крупного рогатого скота—3 мес. после прививки.

    Диагноз на лептоспироз считают установленным при обнаружении нарастания титра антител у исследуемого животного в 5 и более раз при повторном исследовании сыворотки крови или при выявлении специфических антител в диагностических титрах более чем у 25% однократно обследуемых животных.

    Гистологическое исследование. Для гистологических исследований препараты окрашивают гематоксилин-эозином, для обнаружения лептоспир — методом импрегнации серебром по Левадити.

    При остром лептоспирозе гистологически изменения в печени характеризуются отечностью и разрыхлением волокон междольковой соединительной ткани, набуханием и десквамацией звездчатых эндотелиоцитов, наличием ареактивных некрозов, зернистой и жировой дистрофией печеночных клеток; в почках устанавливают зернистую дистрофию и гемосидероз эпителия извитых канальцев, пролиферацию эндотелия капилляров клубочков. При хроническом лептоспирозе и лептоспироносительстве выявляют в печени инфильтрацию интерстициальной ткани лимфоидными и гистиоцитарными клетками, иногда регистрируют мелкие очажки внутридольковых клеточных скоплений; в почках— пролиферацию лимфоидно-макрофагальных клеток с атрофией паренхиматозных элементов вокруг клубочков, в межканальцевой и особенно периваскулярной соединительной ткани, мукоидное и фибриноидное набухание стенок сосудов микроциркуляторного русла.

    Окраска препаратов по Левадити сводится к следующим этапам: фиксация в формалине при 37°С 10—20 мин; уплотнение в течение 3—5 ч в 95° алкоголя; промывание в проточной воде 10 мин, затем в дистиллированной воде 10— 15 мин; обработка 1,5%-ным раствором ляписа в течение 4—5ч при 50°; редукция в течение 4—10 ч при 50° в смеси следующего состава — пирогалловой кислоты — 2—4 г, 40%-ного формалина—5 мл и дистиллированной воды— 100 мл, ополаскивание в воде и заливка в парафин.

    Диагноз считают установленным при обнаружении лептоспир в гистологических препаратах почек или печени, импрегнированных серебром по Левадити.

    В результате перенесенного заболевания формируется продолжительный стерильный иммунитет с прекращением лептоспироносительства. Иммунитет носит группоспецифический характер и предохраняет от повторных заболеваний, вызываемых лептоспирами из одноименной с этиологическим агентом серогруппы. Например: человек, переболевший лептоспирозом Роmоnа, больше не заболеет при контакте с лептоспирами Роmоnа, но лептоспиры Icterohemorragiae могут вызывать повторное заболевание. Опасность развития злокачественного течения болезни требует обязательной госпитализации больных. Лечение лептоспироза должно быть комплексным и включать специфическую (противолептоспирозный иммуноглобулин), этиотропную (пенициллин, а при его непереносимости левомицетин-сукцинат) и патогененическую, направленную на детоксикацию и лечение осложнений, терапию. При отсутствии эффекта от проводимого лечения применяют плазмоферез, гемосорбцию, экстракорпоральный диализ.

    Профилактика лептоспирозов     основана      на      комплексе  медико-санитарных  и ветеринарно-санитарных мероприятий.  Перечень общих профилактических мероприятий,  обязательных  для  учреждений госсанэпиднадзора,  ветеринарной службы,  предприятий, учреждений,  должностных  лиц  и  граждан   Российской   Федерации,   определен  санитарными  правилами  (СП  3.1.091-96) и ветеринарными правилами  (ВП 13.3.1310-96). 
    

    Вопросы профилактики  лептоспирозов  включаются в региональные    программы по вопросам  санитарно-эпидемиологического  благополучия    населения  и профилактики особо опасных инфекций.  При составлении  плана  мероприятий  учитывается  эпидемическая  и   эпизоотическая ситуация  в данной местности,  выясняется этиологическая структура заболеваний,  наличие  природных  очагов,  численность   грызунов,  ветеринарно-санитарное    состояние   животноводческих   хозяйств, использование водоемов при размещении летних  лагерей  для  скота,  осуществление программы мелиорации и др.
    

    Мероприятия по   профилактике   и   борьбе   с   лептоспирозом   проводятся дифференцированию в зависимости от типа очага.
    

    Природные очаги.  Мероприятия в природных очагах сводятся к их    выявлению  и  оздоровлению.  Поиск  эпизоотий  проводится в местах    возможного заражения людей и животных.
    

    При отсутствии  заболеваний зараженных зверьков следует искать  в сырых заболоченных угодьях,  прежде всего в местах, используемых населением  для  хозяйственных  нужд  (пастбища,  территории,  где  проводятся гидротехнические и  мелиоративные  работы,  рисосеяние, освоение  новых  территорий,  трассы  перегона  скота  на отгонное  пастбище,  различные  поисковые  работы  и  др.)  и  отдыха.   При обнаружении зараженных зверьков выясняются интенсивность эпизоотии  и размеры охваченной ею территории.
    

    После этого    разрабатываются   конкретные   мероприятия   по оздоровлению данного очага в зависимости от  его  эпидемической  и эпизоотической   значимости.   Предусматривается   проведение  при  необходимости гидромелиоративных  работ,  а  также  дератизации  в  жилых    помещениях,    животноводческих    хозяйствах   (фермах),  зернохранилищах  и  др.   с   целью   подавления   численности   и  предупреждения  миграции  зараженных  зверьков.  Большое  значение имеет   обеспечение   грызунонепроницаемости   помещений   (жилых, хозяйственных,     промышленных),     повышающее     эффективность  противолептоспирозных мероприятий.
    

    Мероприятия по   оздоровлению  выявленных  всех  типов  очагов  лептоспирозов целесообразно включать в комплексный план по  борьбе  с лептоспирозами или в региональную программу.
    

    Профилактика лептоспирозов   в   урбанизированных   ландшафтах  проводится в соответствии с Методическими рекомендациями Минздрава  России  «Критерии  и  методы  оценки  потенциальной  эпидемической  опасности  очагов  лептоспирозов  в  урбанизированных ландшафтах и   меры профилактики» (Омск, 1997).
    

    Лицам при  работе на территории природных очагов лептоспирозов  следует  соблюдать  правила  личной   профилактики   (использовать  резиновую обувь,  перчатки,  следить за тем, чтобы не было порезов  рук и ног и  т.д.),  а  постоянно  работающим  прививаться  против  лептоспирозов.  Осуществляется  строгий  контроль  за  хранением и  доставкой  питьевой  воды   и   пищевых   продуктов.   Запрещается  употребление  для  питья  некипяченой  воды из открытых водоемов и  купание.
    

    На территории  природных  очагов  лептоспирозов не разрешается  выпас и прогон сельскохозяйственных животных,  не привитых  против  этой инфекции.
    

    С целью  оздоровления  природных очагов иктерогеморрагического  лептоспироза проводятся  дератизационные  работы  на  эпидемически  значимых   объектах,  в  населенных  пунктах  и  открытых  стациях  («Инструкция  по  борьбе  с  серой  крысой  в  открытых  стациях»,    утвержденная Минздравом СССР 5 июня 1984 г.).
    

    Совместно с   заинтересованными   ведомствами  и  учреждениями  обеспечивается   проведение  необходимого  комплекса  санитарно-технических,   санитарно-гигиенических   мероприятий  по дератизации и снижению численности бродячих собак.
    

    Вопросы личной   профилактики   лептоспирозов   включаются   в    санитарный  минимум  или   вводный   инструктаж   для   работников    мясокомбинатов,    животноводческих    хозяйств,   канализационных  сооружений и других групп профессионального риска.
    

    Иммунизация против  лептоспирозов  населению   проводится   по    эпидемиологическим показаниям.
    

    Иммунизации подлежат    лица,    относящиеся     к     группам  профессионального  риска заражения (в любое время года),  персонал   лабораторий,  работающих с патогенными лептоспирами, а также лица,  направляемые на строительные и сельскохозяйственные работы в места  активно действующих природных и хозяйственных очагов лептоспирозов  (не  позднее,  чем за месяц до начала работ).  Контингенты риска и  время   иммунизации   определяются    территориальными    центрами  госсанэпиднадзора.
    

    Проведение прививок     определяется     местными     органами  здравоохранения  в  зависимости  от эпидемической и эпизоотической    ситуации. Для этого анализируется состояние заболеваемости людей и  сельскохозяйственных  животных  (совместно с ветеринарной службой)  за последние годы в каждом населенном пункте.
    

    В выявленных    очагах   лептоспирозов   иммунизируются   лица   повышенного   риска   инфицирования:    ветеринарные    работники,    зоотехники,  телятницы,  свинарки,  доярки,  собаководы,  рабочие,  занятые  оборудованием  или   ремонтом   стойловых   помещений   и   транспортированием  животных,  кормов  и  пр.,  работники очистных   канализационных  сооружений,  складских  помещений,  рыбоводческих   хозяйств,   шахтеры   и   др.  Первостепенное  внимание  уделяется   работникам  субпродуктовых   и   убойных   цехов   мясокомбинатов,   санитарных  боен  и  убойных  пунктов.  Прививкам  также  подлежит  персонал  различных  учреждений  (в  т.ч.  ЦГСЭН  и  противочумных учреждений)  и организаций,  работающих с мелкими млекопитающими в  полевых  условиях  в  природных  очагах  лептоспирозов.  Все   эти  контингенты можно прививать в любое время года.
    

    В эндемичных    по    лептоспирозам     населенных     пунктах  иммунизируются,   главным  образом,  дети,  а  также  -  рисоводы,   мелиораторы и другие лица,  подвергающиеся риску заражения. В этих  случаях прививки проводятся за 2 месяца до эпидсезона.
    

    Прививки проводятся   в   соответствии   с   наставлением   по  применению   лептоспирозной   вакцины.  Иммунизацию  целесообразно   проводить вакцинами  нового  поколения  с  высокими  иммуногенными  свойствами  (например,  концентрированной  лептоспирозной вакциной   производства  Ростовского  НИИ   микробиологии   и   паразитологии  Минздрава России).
    

    В целях   экстренной   антибиотикопрофилактики   лептоспирозов    лицам,  подвергшимся  риску  заражения,  назначается   доксициклин  (вибрамицин) по следующей схеме: 1 капсула (0,1 г) один раз в день   в течение 5 дней.  Решение о  проведении  экстренной  профилактики  принимается территориальными центрами госсанэпиднадзора.
    

      При попадании возможно инфицированного  материала  (при  забое  животных  и  т.п.)  на  кожные  покровы  немедленно  проводится их   обработка  5%-ным  раствором   йода.   Слизистые   оболочки   глаз   необходимо промыть 1%-ным раствором борной кислоты,  струей воды и   ввести в глаза несколько  капель  1%-ного  раствора  азотнокислого   серебра;  в  нос  вводят  1%-ный  раствор протаргола;  рот и горло   прополоскать  0,05%-ным  раствором  марганцовокислого  калия   или    1%-ным раствором борной кислоты.
    

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Список литературы

     

  14. Борисов Л. Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии.–М.: Медицина, 1993. – 240 с.
  15. Букринская А.Г. Вирусология.–М.: Медицина, 2008. –336 с.
  16. Воробьев А.А., Быков А.С., Пашков А.М., Микробиология.–М.: Медицина, 2003.– 336 с.
  17. Елинов Н.П., Заикина Н.А., Соколова Н.П. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии.–М.: Медицина, 1988. – 208 с.
  18. Кочемасова З.Н., Ефремова С.А., Набоков Ю.С. Микробиология.–М.: Медицина, 1984.
  19. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Под ред. Л.Б. Борисова, А.М. Смирновой. –М.: Медицина, 1994. – 528 с.
  20. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология.–М.: Медицина, 1980. – 512 с.
  21. Поздеев О.К. Медицинская микробиология.–М.: ГЭОТАР-МЕД, 2010.– 768 с.

     

     

     

     

     

     


     

<

Комментирование закрыто.

MAXCACHE: 1.03MB/0.00045 sec

WordPress: 22.31MB | MySQL:123 | 1,700sec